Citotoxicidade

A citotoxicidade é definida como o grau que um agente pode ser tóxico ás células, podendo causar lise, ou a morte celular por meio de fenômenos imunológicos como apoptose. Para avaliar a biocompatibilidade de um material o primeiro teste a ser realizado é o de citotoxicidade, pois este permite verificar se o material provoca lise (quebra) nas células, inibição de crescimento celular e outros efeitos que podem ser causados na célula pelo material ou por extratos gerados por ele. A cultura de células neste teste deve ficar em contato com o material, e este contato pode ser direto ou indireto (PARK et al., 2007).

Este estudo foi realizado por meio contato direto das membranas de BN com a cultura de células seguindo as normas ISSO 10993-5 e ASTM F-813, onde o material a ser testado foi depositado sobre a monocamada celular formada no fundo de uma placa de cultivo. Neste teste é necessário utilização de um controle positivo (substância que possui efeito citotóxico de modo reprodutível) e um controle negativo (substância que não apresenta nenhum efeito citotóxico). O contato pode ocorrer por um período de até 408h.

            Após este contato devem ser realizados os testes de citotoxicidade, que podem ser feitos por meio da técnica denominada de viabilidade celular. Esta é uma técnica que utiliza corantes vitais como o vermelho neutro, que é solúvel em água e atravessa a membrana celular, concentrando-se nos lisossomos, fixando-se por ligações eletrostáticas hidrofóbicas em sítios aniônicos na matriz lisossomal. Muitas substâncias danificam as membranas celulares, resultando no decréscimo de captura e ligação do vermelho neutro. Portanto, é possível distinguir entre células vivas e danificadas ou mortas, pela medida de intensidade de cor da cultura celular (CIAPETTI et al., 1996).

As células utilizadas para os testes in vitro de citotoxicidade foram da linhagem NIH3T3 - fibroblastos de camundongos na concentração de 3,0 × 10⁵ células/ml. O volume de 5 ml de células foi cultivado em meio de cultura DMEM (Dubelco's Modified Eagle Medium, marca LGC, Cotia/SP), suplementado com 20% de soro fetal bovino (marca GIBCO, EUA) e 1% de antibiótico penicilina/estreptomicina (marca SIGMA, Alemanha). Este material foi semeado em placas de petri de poliestireno medindo 15x60 mm, e levado a estufa (marca FORMA SCIENTIFIC, USA) a 38°C, 95% de umidade e 5% de CO² durante 72 h. Após este período, ocorreu a formação de monocamada celular. A remoção das células foi realizada por meio da enzima Tripsina em um processo denominado de tripsinização, sendo que após este processo efetuou-se a contagem e o plaqueamento das células, em placas de poliestireno de 48 poços. O volume de 0,2 ml de uma suspensão, contendo 2,5 × 10⁵ células/ml, foi distribuído nos poços da placa, a qual foi posteriormente agitada e incubada por 24h, a temperatura de 37°C, em estufa úmida com 5% de CO₂ para a formação de uma nova monocamada celular para que todo o fundo da placa ficasse revestido pelas células, permitindo um maior contato com o material que seria depositado sobre as mesmas, como pode ser verificado na Figura 5.

Como controle negativo, foi utilizada a própria placa de cultivo, demonstrando na prática a resposta celular em meio biocompatível. Por outro lado, o controle positivo foi composto de fenol 0,02%, comprovando uma resposta citotóxica apropriada no ensaio. Na sequencia, foram colocados os fragmentos das membranas com média de 0,5 cm de diâmetro, juntamente com 3,0 ml meio de cultivo HAM F12 (marca LGC, Cotia/SP), onde permaneceram em contato direto com as células. Realizou-se a análise em três períodos: 24, 48 e 72 h. A citotoxidade foi avaliada com a utilização de corante vermelho neutro (marca SIGMA, Alemanha), seguindo a descrição da norma ISO 10993-5. A placa foi preenchida de forma uniforme, onde a primeira fileira em todos os testes era composta pelo controle positivo, a segunda fileira pelo controle negativo e as demais fileiras pelas amostras de BN. Cabe ressaltar que em todos os testes a placa possuía a mesma constituição, 3 placas foram utilizadas no estudo e cada placa continha o material a ser testado em triplicata.

Após os períodos descritos, o meio de cultura foi substituído por 0,2 ml de meio MEM Minimum Essential Eagle Medium, marca LGC, Cotia/SP), contendo 50µg/ml do corante. Esperou-se 3 h e procedeu-se à remoção do meio. As células foram lavadas com tampão fosfato-salina (PBS), sendo que posteriormente foi efetuada a lavagem com uma solução de 1% CaCl₂ em 0,5% de formaldeído. Descartou-se a solução e os poços foram preenchidos com 0,2ml de uma solução contendo 1% de ácido acético e 50% de etanol. A placa foi agitada por 10 minutos e procedeu-se a leitura para avaliar a absorção do corante pelas células viáveis, em um espectrofotômetro ELX800 (marca BIO-TEK, Brasil) no comprimento de onda correspondente a 540 nm. A partir dos valores obtidos foi possível calcular a média da porcentagem de viabilidade celular em relação ao controle negativo (100%) (BORENFREUND et al., 1988; ROGERO et al., 2003). Na Figura 6 podemos verificar células viáveis antes e após a marcação pelo corante vermelho neutro.

* Extraído de "Estudos Sistemáticos de Biocompatibilidade e Potencial Osteogênico de Membranas Bioativas em Coelhos Machos", Tese de Juliana Ferreira Floriano, 2013.