Genotoxicidade

 A genotoxicidade é definida como a capacidade de agentes químicos em danificar o DNA de uma célula, causando mutações que podem levar ao desenvolvimento de algumas doenças como o câncer (AARDEMA et al., 2002). A avaliação da genotoxicidade é descrita dentro das normas ISO 10993-5, e é parte importante na avaliação da biocompatibilidade de um material, que pode não ser citotóxico, mas causar danos de DNA, que a longo prazo podem induzir as mutações (JHA et al., 2000).

Para avaliar a genotoxicidade das membranas foi utilizado o teste do Cometa, que permite a detecção de danos no DNA de uma célula. As células cultivadas que estiveram em contato com a membrana por um período de 72h foram coletadas e submetidas ao teste, que foi realizado sob condições alcalinas de acordo com um protocolo previamente descrito (TICE et al., 2000), em que 5 µL de uma suspensão com células foram misturadas a 120 µl de agarose baixo ponto de fusão 0,5% (INVITROGEN, EUA) a temperatura de 37ºC e depositadas em lâminas de microscópio convencionais, pré-revestidas com agarose com ponto de fusão normal 1,5% (INVITROGEN, EUA). As lâminas foram colocadas em uma solução de lise recém-preparada (1% de Triton X-100, 2,5 mM de NaCl, 0,1 mM de Na2EDTA, 10 mM de Tris com dimethilsufoxido 10%, pH 10,0) por um período de dois dias. Após este período, o material foi lavado em tampão PBS e colocado em uma cuba horizontal de eletroforese (28 x 17,5 x 6,5 cm, TÉCNICA PERMATRON LTDA, Brasil) contendo tampão alcalino (0,3 M de NaOH, 1 mM de Na2EDTA, pH> 13) a 4ºC durante 20 min. Usando o mesmo tampão, a eletroforese foi realizada a 25 V e 300 mA durante 20 min. Após a eletroforese, as lâminas foram lavadas duas vezes durante 5 min em tampão de neutralização (0,4 M Tris-HCl, pH 7,5), e fixadas durante 5 min em álcool absoluto, secas ao ar, e armazenadas à temperatura ambiente.

 As lâminas foram coradas com 50 µL de brometo de etídio e imediatamente examinadas com uma ampliação de 400x em um microscópio de fluorescência, ligada a um sistema de análise de imagem (Comet II; Perspective Instruments, Suffolk, UK).

Lâminas codificadas foram marcadas de forma cega e 50 nucleoídes foram aleatoriamente analisados. A intensidade da cauda “ Tail intensity ” (quantidade de DNA na cauda do cometa) e momento da cauda “ Tail moment ” (produto da densidade de DNA na cauda e a distância média de migração de DNA na cauda) foram usados para medir a extensão de danos no DNA. Imagens de cometa com uma aparência "nublada" ou com uma cabeça muito pequena e cauda como um balão foram excluídos da análise (HARTMANN et al., 1997). A Figura 7 apresenta imagens do cometa obtidas durante a realização do teste de genototoxicidade.

* Extraído de "Estudos Sistemáticos de Biocompatibilidade e Potencial Osteogênico de Membranas Bioativas em Coelhos Machos", Tese de Juliana Ferreira Floriano, 2013.