Técnica cirúrgica para avaliação da Bioatividade

 Para a avaliação da bioatividade, foram utilizados 24 coelhos adultos, machos da raça Nova Zelândia, que foram distribuídos de forma aleatória em 2 grupos (60 e 90 dias). Os animais foram tratados de acordo com os Princípios Éticos na Pesquisa Animal adotados pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA). A utilização dos animais nesta pesquisa seguiu todas as normas éticas vigentes, e foi aprovado pelo comitê de ética da Universidade Estadual Júlio de Mesquita Filho – UNESP, São Paulo em 11 de janeiro de 2009, sob o número 2612/46/01/08.

 Para realização dos procedimentos cirúrgicos os animais foram tranqüilizados com acepromazina (0,1mg kg-1) e butorfanol (0,1mg kg-1) aplicados por via intravenosa e, 15 minutos após, anestesiados com a associação de tiletamina-zolazepam (10 mg kg-1) e xilazina (0.5 mg kg-1) por via intramuscular.

Após a tricotomia da região do osso frontal os coelhos foram posicionados em decúbito ventral e foi realizada a anti-sepsia da área cirúrgica com iodopovidona e solução fisiológica. Com os panos de campo operatório dispostos foi efetuada uma incisão de pele e tecido subcutâneo, estendendo-se na linha média da protuberância externa do occipital até a altura dos olhos. Os músculos: frontal, interescutular e occipital foram incisados na linha média e afastados com rugina, e retraídos para expor o periósteo do osso parietal.

Foi então criado um defeito crítico circular de aproximadamente 2 cm de diametro  com o uso de trefina de 1 cm de diâmetro, acionada por um micromotor cirúrgico, e abundante irrigação com solução salina 0,9 %. Foram realizadas duas perfuracoes, que foram unidas com o auxílio de um alveolótomo formando um defeito único, todo o procedimento foi realizado de maneira cautelosa com a finalidade de não danificar a membrana dura-máter. O osso cortical e esponjoso foi removido, expondo a membrana meníngea, como pode ser verificado na Figura 10.

Nos coelhos dos grupos em que as membranas de BN dos 2 clones testados foram implantadas, o defeito foi preenchido com um fragmento de membrana medindo cerca de 2cm. Sobre esta membrana e também na borda do defeito foi depositado cerca de 1ml do selante de fibrina para a fixação do segundo fragmento da membrana, que foi colocado de modo a recobrir todo o defeito criado, como pode ser visto na Figura 11.

 No grupo controle negativo, o defeito foi preenchido por coágulo de fibrina. O coágulo fornece um arcabouço para os neutrófilos, monócitos, fibroblastos e células endoteliais, bem como concentra citocinas e fatores de crescimento, permitindo a formação de tecido de granulação, com novos vasos sanguíneos, colágeno e algumas células como fibroblastos e macrófagos. Após ocorrer a diferenciação celular e a maturação da matriz, forma-se o calo ósseo, que é composto de elementos vasculares, cartilagenosos e celulares que serão substituídos por osso e restabelecerá a forma e função (MARTINS et al., 2010).

            Por outro lado, no grupo controle positivo o defeito foi preenchido com membranas de PTFE, seguindo o esquema do grupo tratado com membranas de BN.  O uso deste material como controle positivo é bem aceito e utilizado em muitos estudos de regeneração óssea (BARBER et al., 2007). GARG et al, (2004) relataram que algumas membranas de PTFE possuem vantagens, quando exposta à cavidade oral, não comprometendo o processo de regeneração óssea.  

O periósteo e os músculos afastados foram aproximados com uma sutura contínua simples, o tecido subcutâneo com uma sutura invaginante e a pele com pontos isolados simples. Os fios utilizados foram o náilon 3-0 e o náilon 4-0.

Antes da indução anestésica e 24 horas após o procedimento cirúrgico foi administrada enrofloxacina na dose de 5 mg/kg por via intramuscular. Flunixina meglumina (1mg/kg) foi aplicada por via subcutânea (1mg/kg) a cada 24 horas no pós-operatório imediato e por mais três dias. As feridas cirúrgicas foram tratadas com iodopovidine e os pontos cutâneos foram removidos no 10º dia de pós-operatório.

Os animais permaneceram com os implantes pelos períodos de 60 e 90 dias. Durante o experimento, os animais foram submetidos a exames de Raios X (RX) no equipamento OPTIMA XR 220AMX (marca GE, Brasil), a posição utilizada nas peças coletadas foi antero para posterior (AP) e nos animais sedados a posição utilizada foi perfil. Os exames de RX foram relizados em 3 períodos: 30, 60 e 90 dias após os implantes. As Tomografias computadorizadas (TC) foram realizadas no equipamento Shimadzu, Brasil, modelo SCT-7000, sendo que os cortes foram feitos a cada 1mm, com tempo de 1 segundo (1:1), utilizando um potencial de 120 KV e corrente elétrica de 50 mA. As TCs foram realizadas para avaliar o crescimento e densidade do osso neoformado. Após o período descrito, os animais foram eutanasiados com pentobarbital (>100mg/kg por via intravenosa), após serem anestesiados com quetamina e xilazina.

Após a eutanásia, os animais foram colocados em posição de decúbito ventral e foi realizada nova tricotomia, onde quaisquer alterações nas regiões próximas aos locais de implante foram anotadas. Realizou-se uma incisão vertical da região do osso frontal, possibilitando a visualização da região dos implantes, que foram coletados por meio de uma broca acoplada a um micromotor cirúrgico, com uma margem de aproximadamente 1 cm ao seu redor. As peças foram fixadas em formalina 10% para a realização dos exames.

* Extraído de "Estudos Sistemáticos de Biocompatibilidade e Potencial Osteogênico de Membranas Bioativas em Coelhos Machos", Tese de Juliana Ferreira Floriano, 2013.